目的：建立一个冻干粉针培养基模拟灌装工艺再验证方案，以规范冻干粉针车间培养基模拟灌装工艺验证工作，证明所生产的无菌产品可以在规定的环境、工艺和操作下能有效防止微生物污染，同时确定无菌灌装室内允许的最多人员数量，使生产的注射剂符合产品质量标准，尤其符合无菌标准要求。
培养基模拟灌装是在与实际生产相同的工艺条件和操作方法下，模拟灌装经除菌过滤的胰酪胨大豆胨肉汤培养基适量到抗生素瓶中，压塞后，在3~6℃条件下冻干，轧盖后，按规定条件进行培养，以确认无菌灌装工艺的可靠性。在此验证之前,空气系统、水处理系统、灭菌系统等验证工作均已完成。
通过培养基模拟灌装试验证明，在无菌灌装过程中所采用的各种方法和规程，可使微生物污染的水平达到可接受的合格标准的能力，并提供保证所生产产品的无菌性的置信度达到可接受的合格标准的证据。对整个无菌灌装过程进行验证试验，根据验证结果来评估生产线正常运转时对微生物控制的状况，判断生产过程的可靠性，利用培养基模拟灌装试验来证明，在正常状态下，生产过程是可靠的，满足当产品污染的概率为0.10%时，无菌性的可信限为95%的要求。
验证过程应严格按照本方案规定的内容进行，若因特殊原因确需变更时，应填写验证方案变更申请及批准书，报验证领导小组批准。
3.3.3负责收集各项验证、试验记录，并对试验结果进行分析后，填写验证报告，报验证小组批准。
4.1.1公用工程：⑴空气净化系统验证⑵纯化水系统验证⑶注射用水及纯蒸汽系统验证（4）压缩空气系统验证
4.1.4设备验证及设备清洁验证：相关设备验证及设备清洁验证全部完成且符合要求。
《配剂称量岗位操作规程》、《配剂岗位稀配操作规程》、《灌封岗位操作规程》、《洁净区沉降菌
落测定操作规程》、《进入洁净区的物料清洁操作规程》、《培养基配制操作规程》、《冻干粉针剂车间监控管理规程》
4.5.1所有参加模拟试验的操作人员均应经过GMP、无菌操作、无菌更衣程序技术等相关知识的培训并经考核合格。
4.5.2参加模拟试验的操作人员数及人员构成应严格控制，非规定的验证小组成员严禁在模拟试验过程中进入模拟试验现场，模拟试验现场人员数不得超过5人，人员的进入及退出应严格执行标准操作程序，减少不必要的人员进入及进退出次数。
4.5.3 模拟灌装试验中使用的抗生素瓶和胶塞的清洗、灭菌；设备的清洗、消毒；与产品接触的灌装设备部件的清洗、灭菌；灌装过程必须遵循与实际生产操作相同的标准操作规程。
4.5.4 在培养基灌装设计中，工艺条件的选择应选取合理的“最差条件”，用最差条件来对工艺流程、设备和整个系统进行挑战。最差条件如下：
4.5.4.1 在准备阶段将物料、灌装部件和待灌装的容器按照工艺要求在无菌条件下保存到被允许的最长时间，
4.5.4.2 培养基在灌装前保存在储罐中的时间挑战至最长工艺允许时间，
4.5.4.5 灌装机灌装速度保持略低于生产时灌装速度（根据全批量的操作时间而定），
4.5.4.6 每个容器灌装培养基的量不需要和实际生产时完全一样。可以根据容器大小来确定灌装量，但必须保证灌装后将容器来回翻转，培养基可以完全接触到容器和密封件内表面，
每批灌装应≥5000瓶，按每瓶灌装胰酪胨大豆胨肉汤培养基2.5ml计，除去损耗，约需胰酪胨大豆胨肉汤培养基粉末0.6Kg（配置成20L）。三批共需培养基粉末1.8Kg。
5.1.2.1超声波清洗后，310℃，≥10分钟干热灭菌。灭菌后做无菌检查，应符合规定。
5.1.2.2执行《细菌内毒素检查标准操作规程》，每瓶用20ml内毒素检查用水荡洗后做内毒素检查，
5.1.3.2执行《细菌内毒素检查标准操作规程》，取胶塞40只，加入100ml内毒素检查用水震荡后，
5.2.1.1菌种：培养基灵敏度检查所用的菌株传代次数不得超过5代（从菌种保存中心获得的冷冻
干燥菌种为第0代）,并采用适宜的菌种保藏技术,以保证试验菌株的生物学特性，选择以下三种菌
5.2.1.2 试验用设备及材料：冰箱、恒温培养箱、高压真空灭菌锅、恒温干燥箱、刻度吸管、90mm
培养皿、大试管、小试管、试管架、天平、接种环、酒精灯、洁净工作台、培养基、灭菌生理盐水。
5.2.1.3 菌液制备：接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤中，30—35℃培养18-24小时；接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中，23—28℃培养24-48小时，上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数小于100cfu（菌落形成单位）的菌悬液；接种黑曲霉菌的新鲜培养物至改良马丁培养基上，23—28℃培养5-7天。加入3-5ml 0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后，吸出孢子悬液（用管塞有适量疏松的无菌棉花或纱布能过滤菌丝的无菌毛细吸管）至无菌试管内，用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数小于100cfu的孢子悬液。
5.2.1.4培养基接种：取每管装量15ml胰酪胨大豆肉汤培养基，分别接种金黄色葡萄球菌、铜绿假
单胞菌、枯草芽孢杆菌各2支，每支接种菌量1ml（菌量小于100cfu），另一支不接种，作为空白对
照，30—35℃培养5天。取每管装量为15ml的胰酪胨大豆肉汤培养基5支，分别接种白色念珠菌、
黑曲霉菌各2支，每支接种菌量为1ml（菌量小于100cfu），另一支不接种，作为空白对照，23—28℃
5.2.1.5结果判断：空白对照管应无菌生长，若加菌的培养基管均生长良好，则该培养基的灵敏度
5.2.2 完整性测试：将挑战菌株接种在不少于1000ml的大豆胰蛋白胨液体培养基中培养以制备试验菌悬液。使用前菌悬液中挑战菌浓度不低于每毫升106CFU。将100个挑战瓶倒置于试验菌悬液中，并应确保瓶身、瓶颈和瓶盖外表面浸没于菌悬液中。浸没时间不应少于4 小时。浸侵结束后将挑战瓶取出并将外表面擦拭干净。然后将每瓶容器来回翻转，确保容器的内表面和胶塞内表面跟培养基完全接触。然后在阳性对照相同条件下培养至少7 天后目视检查。如果阳性对照生长良好而挑战瓶内无生长，表明无菌容器系统的完整性测试通过。
将刚刚灌装的100支培养基，盖塞、封口。其中50支放于30～35℃下培养14天，同时将另外50支放于23～28℃下培养14天。14天内各试管培养基中应无任何微生物生长。
在模拟灌装过程的前、中、后段，随机抽取100支，1/2接种小于100CFU的枯草杆菌芽胞，另外1/2接种小于100CFU的白色念珠菌，分别在30～35℃和23～28℃条件下各培养7天，7天内至少有50%的接种抗生素瓶内的培养基中有明显的接种微生物生长，并以此作为阳性对照。
对无菌区墙壁、门、设备以及操作人员可能接触的各种表面进行无菌检验。其取样方法、取样点、取样频率见取样计划。在进行取样时其取样面积应保持在25cm2。检验结果应符合下表规定。
检查参加模拟试验的操作人员洁净服和手套：每批无菌试验抽取无菌灌装间操作人员2人做此项检查。操作工手套每只取1个样，每个样用无菌棉签擦拭25cm2面积，全部检出菌数应﹤1CFU，；操作过程穿的无菌服每人取两只前臂及前胸共3个样，每个样用无菌棉签擦拭25cm2面积，每个取样点﹤5CFU。
对一侧内墙壁，无菌灌装区内门把手，胶塞清洗机开门螺旋，灌装机上塞料斗，西林瓶灭菌烘干隧道出口处、理瓶转盘，灌装机控制面板，物料周转桶、周转托盘等取样点取样做无菌检查，应符合规定。
①、操作人员无菌性检查取样点：操作人员的无菌服、手套、胸前、前臂等部位。
②、无菌灌装区无菌性检查取样点：其取样重点为无菌灌装区内墙壁、门、设备表面以及操作人员可能接触的各种表面。每次取样应包括：一侧内墙壁，无菌灌装区内门把手，胶塞清洗机开门螺旋，灌装机上塞料斗，西林瓶灭菌烘干隧道出口处理瓶转盘，灌装机控制面板，物料周转桶、周
③、空气微生物数量监测沉降平皿法取样点：取样点见附件《冻干粉针剂培养基无菌灌装模拟试验空气微生物监测沉降菌平皿取样点分布图》。
④、空气微生物数量监测浮游菌测试取样点：按无菌灌装区面积等分进行取样，每个测试点距离1米，测试点距内墙面0.5米，另外在灌装面、胶塞清洗机胶塞出口处、西林瓶灭菌烘干隧道出口处分别增加一个测试点。
⑤、尘埃粒子监测取样点：按无菌灌装区面积等分进行取样，每个测试点距离1米，测试点距内墙面0.5米，另外在灌装面、胶塞清洗机胶塞出口处、西林瓶灭菌烘干隧道出口处分别增加一个测试点。
上述相关物料的预处理、相关实验、生产环境、人员及设备检查均已完成，按每批不少于5000瓶的批量进行培养基模拟无菌灌装。
5.4.1确定每个灌装室内的房屋面积及可能允许的最多人数：5ml： m2大约容纳5人。
2ml无菌灌装室内先允许包括操作工在内的6名人员进入，30min后监测其沉降菌、浮游菌及尘埃粒子数。
5.4.2启动粉针联动生产线，模拟实际生产的条件下，将胰酪胨大豆胨肉汤培养基灌装到7ml抗生素瓶中，装量2.5ml/支，盖塞，然后放到传送带上，自动传送至轧盖间。在轧盖机上轧盖，已轧盖的样品，放入不锈钢托盘内，每一个托盘均应粘贴托盘标记，明确标示以下内容：托盘编号、生产起始时间与结束时间、备注等。备注应特别标记生产过程中修机前后托盘，以便于调查其污染原因。并记录。然后，将托盘按编号顺序依次放到冻干机中，冷冻温度不得低于3℃。冻干时间设定为24小时，抽真空（真空度：）、全压塞后按生产工艺要求进行铝盖密封作业。至此供试品已全部制备完成。
5.5.1 每瓶在培养前和培养中间阶段都要来回翻转，这样确保容器的内表面和胶塞内表面跟培养基完全接触，模拟灌装生产的全部样品在适宜的温度下培养14天，先在较低温度（23～28℃）下培养7天，然后在较高温度（30～35℃）下培养7天。在第三天和第七天之间至少观察培养基灌装品的微生物生长情况一次，并且在检测期间的最后一天至少再观察一次，并对污染瓶中的微生物进行总结其特点。
5.5.2结果判定：经试验灌装好的培养基按以上要求培养14天后，应将每瓶培养基对着灯光仔细目测。透明、澄清、无混浊的培养基判为无微生物生长；培养基混浊或有悬浮的菌丝或菌落，则需
做进一步的微生物生长检查，以确定培养基是否真正染菌。一旦确认染菌，应明确记录瓶号、瓶数，
同时应检查铝盖、胶塞的密封情况；若有破损应记录并检查其破损原因。对微生物污染的样品应进行鉴别试验，鉴别的内容至少应包括菌落、细胞形态学及革兰氏染色特性等。
评价无菌模拟灌装试验结果的主要指标之一是微生物污染水平，如果试验结果证明其污染水平超过规定的合格限度（灌装2996~4742瓶时，允许阳性数量为0瓶，灌装4743~6294瓶时，允许阳性数量为1瓶），则应立即停止生产，调查并记录污染产生的原因。在调查结束并采用相应的措施后应重复进行培养基无菌模拟灌装试验。
原因调查结束后，应根据调查所确定的或可能发生的原因制定纠正或改进方案并予以实施。当改进方案实施之后应重复模拟灌装试验。
7.1对于新建的冻干粉针剂生产线在其正式投入生产前必须进行培养基无菌模拟灌装试验，合格后才可投入生产；
7.3每个在冻干粉针剂灌装生产线上的工作人员，每年至少参加1次成功的培养基无菌模拟灌装试验；
7.4当生产用设备、设施，从事冻干粉针剂灌装生产操作的人员结构，工艺方法有重大改动时均必须进行培养基无菌模拟灌装试验，以证明其改动对已经验证了的冻干粉针剂灌装工艺过程不产生不
8.1 根据冻干粉针培养基模拟灌装设计方案及技术参数、根据提供的技术资料及验证情况对模拟灌装过程进行分析评价。拟定再验证周期。
8.2 验证小组根据综合分析结果进行总结，做出验证结论，起草验证报告，报验证小组负责人审批。
8.3.3 验证试验结果是否符合标准要求，是否有偏差，如有，偏差的说明是否合理。是否需进一步补充试验。
验证方案由验证小组负责人审核批准,方案一经批准应严格按照方案规定的内容进行，若因特殊原因，确实需要变更，应填写验证方案变更申请书，报验证小组负责人批准。出现偏差，填写工艺验证偏差处理单，报验证小组负责人审批。
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